2023年2月JACS文章：细菌细胞色素P450terp催化机制研究

今天推送的文章是，2023年2月发表于Journal of the American Chemical Society的“Cooperative Substrate Binding Controls Catalysis in Bacterial Cytochrome P450terp (CYP108A1)”，其通讯作者是，来自美国加州大学欧文分校化学系的Alec H. Follmer教授。

细胞色素P450的催化循环已得到充分研究，然而对于这些酶调节其有效中间体形成的机制，人们知之甚少，对于防止蛋白质支架意外氧化的机制，同样知之甚少。目前，人们对P450s分子水平细节的大部分了解，来源于对恶臭假单胞菌P450cam (CYP101A1)的研究，它是首个被测序的P450，其晶体结构也已得到解析。随着对更多P450s进行详细的机理研究，P450cam展现出一些不寻常的调节特征。Pdx与P450cam结合，致使Pdx出现特异性的诱导构象改变，进而触发氧气激活所需的质子中继网络的形成。最近，P450cam被发现拥有第二个变构底物结合位点，且在与血红素铁配体结合时发生复杂的结构变化。

鉴于P450cam源自以樟脑作为唯一碳源的恶臭假单胞菌，作者猜测其他把萜类天然产物当作唯一碳源的假单胞菌P450s或许具备相似的特性。其中一个例子是P450terp (CYP108A1)，该酶将α-松油醇氧化当作碳源，经由羟基化，形成7-羟基松油醇(方案1)。CYP108A1是第二个被鉴定出的假单胞菌P450，到现在都没有对其与底物复合物的结构进行表征。本文报道了P450terp与其底物α -松油醇共结晶的晶体结构。这种结构揭示出活性位点内有两个α -松油醇分子，这意味着P450terp可能呈现出同向变构控制。本研究借助光谱滴定法，利用等温滴定量热法（ITC），通过定点突变，依据晶体结构，运用分子动力学（MD）模拟，对这种可能性展开了探索。

P450terp的晶体结构

最初作者进行猜测，底物结合时，P450terp会采用更为封闭的构象，原因是在其他P450s中观察到“开 - 闭”构象的转变极为普遍。所以，作者在底物存在的情况下对P450terp（2.0 Å）进行了共结晶。对SF（P450terp）与SB（P450terp - 底物）的结构进行比对，这一比对揭示出它们之间的Cα - RMSD是0.26 。与P450cam相比，SB P450terp显示出更开放的活性位点，这是因为F - G环无序以及G螺旋的定位，这表明P450terp可能不会经历在其他P450s中观察到的开放/闭合运动。在P450cam里，这些运动会让整个酶的残基间偶联发生改变，即便与底物的关键相互作用改变了，区域选择性依然能保留下来。SB结构在活性位点展示出两个α-松油醇分子，SB P450terp结构的表面呈现揭示了进入活性位点的两个通道。

在活性部位内，最接近血红素的底物分子（terp1）电子密度十分清晰，被激活的C7处在距离血红素铁4.2 Å的位置（图2A），在P450cam里，相应底物C5与血红素铁的距离是4.0 Å 。近端底物由Phe317和Phe414提供的关键非极性接触所保持，近端底物还由底物羟基与Ser101和Thr103的侧链之间的氢键相互作用所保持。在terp1上方，显示出第二个底物分子(terp2)的电子密度网络(图1C)。Terp2的两个构象与Phe188的侧链有明显的相互作用，其中一个构象和Tyr80的苯酚侧链形成氢键，这在图1D中有显示，两个底物间最近距离是4.0 Å，两种底物间大部分相互作用是由周围残基的非极性接触介导的。

图1

图2

随后作者对P450terp的活性位点做了突变，结果表明，单突变体F188A使第二个底物分子的结合被削弱，双突变体S101A/T103A让第一个底物分子的结合遭破坏，三突变体S101A/T103A/F188A同时对两个底物分子的结合造成干扰。

底物结合的紫外光谱

在没有α - 松油醇时，三种突变体的UV - vis光谱和野生型几乎一样，呈现出相似的Soret值，如图3A所示 。然而，在有1 mM α - 松醇存在的情况下，这些突变体展现出明显不同的Soret强度分布 。单突变体F188A的Soret带呈现出部分蓝移的情况（如图3B所示），即便处于高底物浓度（10 mM）的条件下，其Soret带也无法完全相互转变为SB的对应光谱。S101A/T103A突变体的Soret移位比F188A突变体小，这是因为与第一个底物分子的氢键相互作用的消除，大大降低了结合亲和力，S101A/T103A/F188A显示出最小的位移，原因是两个底物位置的关键相互作用都被消除(图3C) 。

图3

α-松油醇的结合亲和力

作者为验证底物在P450terp活性位点中协同作用的假设，通过紫外光谱滴定和ITC测量了α - 松油醇与WT和F188A的结合亲和力。根据光谱滴定结果，WT P450terp的Hill系数为1.41，这表示正协同性，且与前面的假设一致(图4A)。然而，F188A的Hill系数是1.01，这表明其缺乏协同性（见图4B）。WT的光谱结合常数KS为2.67 μM，F188A变体的光谱结合常数是36.1 μM，这反映出F188A中α - 松油醇对第一个底物结合位点的亲和力下降了。

ITC对以上结果进行了验证，WT P450terp与α-松油醇的滴定是由焓驱动的，WT的解离常数KD分别是1.19和31.2 μM，位点占据率分别为1.18和0.931，这与双位点结合模型一致(图4C) 。对于F188A，随着对第二位点亲和力降低，观察到了底物结合，底物结合显示出明显的熵驱动，其解离常数KD为33.6 μM，该解离常数与单个结合位点模型相匹配(图4D) 。

图4

周转率与耦合效率

第1类P450系统进行翻转时，电子需在NADH分子与三个独立蛋白之间穿梭，所以作者通过测定NADH消耗来间接测试P450terp的翻转活性，耦合效率是消耗的NADH分子与形成的产物量的比率。结果显示，P450terp具备670 min-1的高翻转率，S101A/T103A/F188A的翻转率仅为0.193 min-1，相关数据在表2中(表2)。此外，P450terp的耦合效率为96.9%，其突变体S101A/T103A的耦合效率为70.6%，突变体F188A的耦合效率为51.2%，突变体S101A/T103A/F188A的耦合效率为3.7%，虽然WT P450terp表现出高周转率，其数值为670 min-1，且表现出高耦合性，其数值为97%，但S101和T103位点的突变显著降低了周转率，同时也显著降低了耦合程度，其数值为70.6% 。其中三点突变体表现出更低的周转率，其中三点突变体表现出更低的耦合效率，主要结合位点受到影响，次要结合位点也受到影响，这同样证明了这些关键残基的重要作用。

分子动力学模拟

P450terp的底物稳定性借助对每个变体开展5个200ns MD模拟来评估，对活性位点有一个底物的WT进行了模拟，对活性位点有两个底物的WT进行了模拟，对与两个α -松油醇分子结合的三个突变体进行了模拟。通过两个距离指标来评估terp1在P450terp活性位点中的稳定性，这两个距离指标分别是血红素质心到terp1质心的距离，以及从Fe到羟基化的α-松油醇的碳（C7）的距离。

当WT P450terp在活性部位仅有一个底物分子（terp1），距离分布出现了显著改变，血红素中心到terp1中心的距离是5.65和6.95 Å (表3) 。P450terp和两分子α - 松油醇结合，此时血红素中心到terp1中心的距离分别是4.90 Å、6.75 Å和8.60 Å，到terp2中心的距离分别是11.40 Å、14.75 Å和20.40 Å 。双突变体S101A/T103A的距离谱跟野生型P450terp的距离谱相似。WT酶中terp2被去除，F188突变为丙氨酸，这两种情况都使活性位点构象柔性增加。在大多数模拟的构象中，α - 松油醇的羟基化碳（C7）仍是离血红素铁最近的碳（约4.5 Å）。不过，当只有一个底物与活性位点结合，或者存在F188A突变时，距离分布会扩大。总之，这些模拟支持了terp2在稳定terp1中的重要性。

综上所述，本研究揭示了P450terp的晶体结构，还揭示了其两个底物结合位点，通过突变实验验证了底物结合的关键残基，借助光谱滴定法和等温滴定量热法证明了P450terp具有底物协同效应，同时结合分子动力学模拟揭示了其复杂的底物结合特性。

END

DOI：10.1021/jacs.2c12388